組織糖原磷酸化酶 a 活性酶連續(xù)循環(huán)比色法定量檢測(cè)試劑盒-技術(shù)資料/價(jià)格-赫澎上海生物
HEPENGBIO 組織糖原磷酸化酶 a 活性酶連續(xù)循環(huán)比色法定量檢測(cè)試劑盒
產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)
主要用途
HEPENGBIO 組織糖原磷酸化酶 a 活性酶連續(xù)循環(huán)比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)糖原磷酸化酶 a 、 磷酸葡萄糖變位酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的酶連續(xù)反應(yīng)系統(tǒng)中氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADP) 還原后峰值的增高,即采用比色法來(lái)測(cè)定組織裂解萃取樣品中酶活性的方法。其適用于各種組織裂解萃取懸液樣品 (動(dòng)物、人體、 昆蟲(chóng)等) 糖原磷酸化 酶 a 的特異活性檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌,即到即用,操作簡(jiǎn)捷,性能穩(wěn)定。
技術(shù)背景
糖原磷酸化酶 (glycogen phosphorylase;EC2.4. 1. 1) 是磷酸化酶家屬之一,在機(jī)體糖原分解 (glycogenolysis ) 利用上發(fā)揮重要作用。其結(jié)構(gòu)為同源雙體,有兩種組合形式:緊密型 (tense) 和松弛型 (relaxed) 。處于緊 密型的酶與糖原結(jié)合,增強(qiáng)活性。未經(jīng)修飾的酶 (糖原磷酸化酶b) 催化產(chǎn)生足夠的葡萄糖- 1-磷酸,進(jìn)入 糖酵解循環(huán),生成ATP 。糖原磷酸化酶催化糖原上α (1→4) 糖苷鏈 (glycosidic linkage) 的磷酸分解 (phosphorolytic cleavage) 反應(yīng),釋放葡萄糖- 1-磷酸產(chǎn)物。糖原磷酸化酶在肝組織、肌肉組織和腦組織中 有不同類型的異構(gòu)體。糖原磷酸化酶分為a型和b型:a型為活化狀態(tài),而b型為非活化狀態(tài),在單磷酸腺苷 (AMP) 的激活下,轉(zhuǎn)化為a型。糖原磷酸化酶的缺失將導(dǎo)致肌肉營(yíng)養(yǎng)不良癥 (McArdle綜合征) 和肝磷酸 化酶缺乏癥 (Hers病) ?;诘孜锾窃?(glycogen),在糖原磷酸化酶無(wú)需AMP激活劑的存在, 由糖原磷酸 化酶a催化其分解并產(chǎn)生葡萄糖- 1-磷酸 ( α-D-Glucose- 1-Phosphate ) 產(chǎn)物后,通過(guò)磷酸葡萄糖變位酶 (phosphoglucomutase;PGLUM) 和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 (glucose-6-phosphate dehydrogenase;G-6-PDH) 反應(yīng)系統(tǒng),測(cè)定氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADP) (oxidized nicotinamide adenine dinucleotide phosphate ;NADP) 轉(zhuǎn)化為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate ;NADPH) 所產(chǎn)生的吸光峰值的變化 (340nm 波長(zhǎng)) ,來(lái)定量分析糖原磷酸化酶a 的特異活性。 糖原磷酸化酶a酶連續(xù)循環(huán)反應(yīng)系統(tǒng)為:
glycogen phosphorylase a
(glycogen) n + Pi → (glycogen) n-1 + α-D-Glucose- 1-Phosphate
phosphoglucomutase
α-D-Glucose- 1-Phosphate → α-D-Glucose-6-Phosphate
glucose-6-phosphate dehydrogenase
α-D-Glucose-6-Phosphate + β-NADP → 6-Phosphogluconate + β-NADPH
(低吸收峰) (高吸收峰)
產(chǎn)品內(nèi)容
HEPENGBIO 清理液 (Reagent A) 30 毫升
HEPENGBIO 裂解液 (Reagent B) 6 毫升
HEPENGBIO 緩沖液 (Reagent C) 10 毫升
HEPENGBIO 底色液 (Reagent D) 1 毫升
HEPENGBIO 反應(yīng)液 (Reagent E) 1 毫升
HEPENGBIO 陰性液 (Reagent F) 500 微升
產(chǎn)品說(shuō)明書(shū) 1 份
保存方式
保存 HEPENGBIO 緩沖液 (Reagent C)、HEPENGBIO 底色液 (Reagent D) 和 HEPENGBIO 反應(yīng)液 (Reagent E) 在-20℃冰箱里; 其余的保存在 4℃冰箱里,HEPENGBIO 底色液 (Reagent D) 和 HEPENGBIO 反應(yīng)液 (Reagent E) 避免光照;有效保證 6 月
用戶自備
1.5 毫升離心管:用于樣品制備和保存的容器
15 毫升錐形離心管:用于樣品制備的容器
(微型) 臺(tái)式離心機(jī):用于樣品制備
比色皿或 96 孔板:用于比色的容器
分光光度儀或酶標(biāo)儀:用于比色分析
實(shí)驗(yàn)步驟
實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前,將-20℃冰箱里的試劑盒中的 HEPENGBIO 裂解液 (Reagent B) 置入冰槽里融化。然后 進(jìn)行下列操作。
一、 樣品準(zhǔn)備
1 . 手術(shù)取出動(dòng)物組織,并秤重以確定組織重量
2 . (選擇步驟) 放進(jìn)預(yù)冷的 15 毫升錐形離心管
3 . (選擇步驟) 加入適量的 (500 毫克組織需要 3 毫升) HEPENGBIO 清理液 (Reagent A) 清洗 1 次
4 . 移入到一個(gè)液氮凍存管
5 . 即刻放進(jìn)液氮罐過(guò)夜
6 . 次日從液氮罐里取出,即刻 (最快速度) 用研磨棒碾碎組織成粉末狀 (注意:切莫使組織凍融)
7 . 放進(jìn)一個(gè) 15 毫升錐形離心管
8 . 加入置于冰槽里的 500 微升 HEPENGBIO 裂解液 (Reagent B)
9 . 轉(zhuǎn)移到 1.5 毫升離心管
10.強(qiáng)力渦旋震蕩 30 秒,充分混勻
11.放進(jìn)冰槽里孵育30 分鐘,期間每 10 分鐘強(qiáng)力渦旋震蕩 30 秒 (注意:如需暫時(shí)停止,放進(jìn)-70℃冰箱 里儲(chǔ)存?zhèn)溆?
12.即刻放進(jìn) 4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心 10 分鐘,速度為 16000g (或 13000RPM。例如 EPPENDORF 5415)
13.小心移取上清液到新的 1.5 毫升離心管
14.移取 10 微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè) (注意:建議使用HEPENGBIO Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒
)
15.放進(jìn)-70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用
二、 測(cè)定準(zhǔn)備
1 . 開(kāi)啟并設(shè)定好分光光度儀 (溫度為 30℃):波長(zhǎng) 340nm ,間隔 60 秒,讀數(shù) 6 次 (共 5 分鐘),并置零
2 . 從-20℃冰箱里取出試劑,置于冰槽里融化;HEPENGBIO 底色液 (Reagent D) 避免光照
3 . HEPENGBIO 緩沖液 (Reagent C) 室溫下均衡溫度
三、 背景對(duì)照測(cè)定
1 . 移取 780 微升 HEPENGBIO 緩沖液 (Reagent C) 到新的比色皿
2 . 加入 100 微升 HEPENGBIO 底色液 (Reagent D)
4 . 加入 100 微升 HEPENGBIO 反應(yīng)液 (Reagent E)
5 . 上下傾倒數(shù)次,混勻
6 . 在 30℃溫度下孵育 3 分鐘
7 . 加入 20 微升 HEPENGBIO 陰性液 (Reagent F)
8 . 上下傾倒數(shù)次,混勻 (限定在 3 秒之內(nèi))
9 . 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè),此為背景空對(duì)照 (5 分鐘讀數(shù)-0 分鐘讀數(shù))
四、 樣品測(cè)定
1 . 移取 780 微升 HEPENGBIO 緩沖液 (Reagent C) 到新的比色皿
2 . 加入 100 微升 HEPENGBIO 底色液 (Reagent D)
3 . 加入 100 微升 HEPENGBIO 反應(yīng)液 (Reagent E)
4 . 上下傾倒數(shù)次,混勻
5 . 在 30℃溫度下孵育 3 分鐘
6 . 加入 20 微升待測(cè)樣品 (100 微克蛋白) (注意:樣品須清澈,且pH 為6.8)
7 . 上下傾倒數(shù)次,混勻 (限定在 3 秒之內(nèi))
8 . 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè),此為樣品讀數(shù) (5 分鐘讀數(shù)-0 分鐘讀數(shù))
五、 計(jì)算樣品活性
[ (樣品讀數(shù)-背景讀數(shù)) X 1 (體系容量;毫升) X 樣品稀釋倍數(shù)]÷ [0.02 (樣品容量;毫升) X 6.22 (毫摩 爾吸光系數(shù)) X 5 (反應(yīng)時(shí)間;分鐘) ] =單位/毫升÷ (樣品蛋白濃度) 毫克/毫升=單位/毫克
單位=微摩爾 NADP/分鐘
六、 酶標(biāo)儀測(cè)定
1 . 在 96 孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記:背景對(duì)照和樣品
2 . 分別移取 195 微升 HEPENGBIO 緩沖液 (Reagent C) 到所有孔里
3 . 分別加入 25 微升 HEPENGBIO 底色液 (Reagent D) 到所有孔里
4 . 分別加入 25 微升 HEPENGBIO 反應(yīng)液 (Reagent E) 到所有孔里
5 . 輕輕搖動(dòng) 96 孔板
6 . 在 30℃溫度下孵育 3 分鐘
7 . 分別加入 5 微升 HEPENGBIO 陰性液 (Reagent F) 或待測(cè)樣品 (100 微克蛋白) (注意:樣品須清 澈,且pH 為6.8) 到相應(yīng)孔里
8 . 輕輕搖動(dòng) 96 孔板
9 . 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè),包括 0 分鐘讀數(shù)和 5 分鐘讀數(shù))
10.活性計(jì)算
[ (樣品讀數(shù)-背景讀數(shù)) X 樣品稀釋倍數(shù) X 0.25 (體系容量;毫升) ]÷ [0.005 (樣品容量;毫升) X 6.22 (毫摩爾吸光系數(shù)) X 0.6 (光徑距離;厘米) X 5 (反應(yīng)時(shí)間;分鐘) ] =單位/毫升÷ (樣品蛋白濃度) 毫 克/毫升=單位/毫克
單位=微摩爾 NADP/分鐘
注意事項(xiàng)
1 . 本產(chǎn)品為 10 次 (比色皿) 和 40 次 (酶標(biāo)儀) 操作,包括背景對(duì)照
2 . 操作時(shí),須戴手套
3 . 系統(tǒng)操作過(guò)程中,背景測(cè)定只需 1 次
4 . 建議使用比色皿測(cè)定
5 . 樣品須澄清,至關(guān)重要
6 . 加樣后3 秒內(nèi)比色測(cè)定
7 . 測(cè)定值由低到高變化;測(cè)定可持續(xù) 5 分鐘
8 . 比色測(cè)定后,比色皿須清洗徹底
9 . 樣本測(cè)定 5 分鐘讀數(shù)高于 0 分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
10.建議待測(cè)樣本蛋白濃度為 100 微克/20 微升;如果樣本酶活性過(guò)低或過(guò)高, 則可以增加或降低樣本量 (本公司提供 Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒- )
11.如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低,可以調(diào)整樣品濃度
12.糖原磷酸化酶 a 單位活性定義為:在 30℃,pH 6.8 條件下,每分鐘內(nèi)能夠轉(zhuǎn)化 1 微摩爾糖原和正磷酸 (orthophosphate ) 至葡萄糖- 1-磷酸所需的酶量作為一個(gè)活性單位
13.本公司提供系列細(xì)胞磷酸化酶學(xué)檢測(cè)試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
1 . 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2 . 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感