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細胞醛糖還原酶(aldose reductase;AR)活性光度法定量檢測試劑盒-技術(shù)資料/價格-赫澎上海生物

細胞醛糖還原酶(aldose reductase;AR)活性光度法定量檢測試劑盒
產(chǎn)品說明書
主要用途
HEPENGBIO細胞醛糖還原酶(aldose reductase;AR)活性光度法定量檢測試劑是一種旨在通過底物葡糖醛酸,在醛糖還原酶的催化作用下,產(chǎn)生山梨醇,伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化后峰值的降低,即采用光度法來測定樣品中酶活性的方法。其適用于各種細胞(動物、人體、昆蟲等)裂解懸液樣品醛糖還原酶的活性檢測。產(chǎn)品嚴格無菌,即到即用,操作簡捷,性能穩(wěn)定。
技術(shù)背景
醛糖還原酶(aldose reductase;ALR2,EC1.1.1.21)是一種NADPH依賴性氧化還原酶,屬于醛酮還原酶(aldo-keto reductase;AKR)超級家族成員之一,催化各種醛類和羰基化合物的還原反應(yīng),特別是葡萄糖還原為山梨醇的反應(yīng),是葡萄糖代謝中多元醇(polyols)通路的第一步反應(yīng)的關(guān)鍵限速酶。醛糖還原酶主要在人體肝組織、晶狀體、視網(wǎng)膜、雪旺氏細胞、胎盤組織和紅細胞中表達。醛糖還原酶與糖尿病并發(fā)癥相關(guān),包括白內(nèi)障、神經(jīng)病變、腎臟病變、視網(wǎng)膜病變、動脈粥樣硬化等,由此成為藥物靶標?;诘孜锲咸侨┧幔╣lucuronate),在醛糖還原酶的催化作用下,產(chǎn)生山梨醇(sorbitol),同時其輔酶因子還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate;β-NADPH)轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(oxidized nicotinamide adenine dinucleotide phosphate;β-NADP),通過測定吸光值的變化(340nm 波長),來定量分析醛糖還原酶的活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為:
 
    ALR2
Glucuronate  +  β-NADPH  →   sorbitol  +  β-NADP  
 
產(chǎn)品內(nèi)容
 
HEPENGBIO清理液(Reagent A) 120毫升
HEPENGBIO裂解液(Reagent B)  10毫升
HEPENGBIO緩沖液(Reagent C)  20毫升
HEPENGBIO反應(yīng)液(Reagent D)   2毫升
HEPENGBIO底物液(Reagent E)   2毫升
HEPENGBIO陰性液(Reagent F)  500微升
產(chǎn)品說明書      1份
 
保存方式
 
保存在-20℃冰箱里;HEPENGBIO反應(yīng)液(Reagent D)和HEPENGBIO底物液(Reagent E)避免光照;有效保證6月
 
 
用戶自備
 
1.5毫升離心管:用于樣品制備和保存的容器
15毫升錐形離心管:用于樣品制備的容器
細胞刮脫棒:用于細胞脫離
(微型)臺式離心機:用于樣品操作
比色皿或96孔板:用于光度的容器
分光光度儀或酶標儀:用于樣品光度分析
 
實驗步驟
 
實驗開始前,將-20℃冰箱里的試劑盒中的HEPENGBIO裂解液(Reagent B)置入冰槽里融化。然后進行下列操作。
 
一、 樣品準備
 
1. 準備好75cm2細胞培養(yǎng)瓶或100mm細胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細胞(1至5 X 107細胞)
2. 小心加入3毫升HEPENGBIO清理液(Reagent A),覆蓋生長表面
3. 小心抽去清理液
4. 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞(注意:可以使用胰酶消化)
5. 加入3毫升HEPENGBIO清理液(Reagent A),混勻細胞
6. 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管(注意:懸浮細胞從這一步驟開始)
7. 放進4℃臺式離心機離心5分鐘,速度為300g
8. 小心抽去上清液
9. 加入500微升HEPENGBIO裂解液(Reagent B),充分混勻
10. 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
11. 強力渦旋震蕩15秒
12. 置于冰槽里孵育30分鐘
13. 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘,速度為16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415)
14. 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
15. 移取10微升進行蛋白定量檢測(注意:建議使用HEPENGBIO Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒)
16. 即刻放進-70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
 
二、 測定準備
 
1. 開啟并設(shè)定好分光光度儀(溫度為25℃):波長340nm,間隔2分鐘,讀數(shù)6次(共10分鐘),并置零
2. 從-20℃冰箱里取出試劑,置于冰槽里融化;HEPENGBIO底物液(Reagent E)避免光照
3. HEPENGBIO緩沖液(Reagent C)室溫下均衡溫度
 
三、 背景對照測定
 
1. 移取750微升HEPENGBIO緩沖液(Reagent C)到新的比色皿
2. 加入100微升HEPENGBIO反應(yīng)液(Reagent D)
3. 加入100微升HEPENGBIO底物液(Reagent E)
4. 上下傾倒數(shù)次,混勻
5. 在25℃溫度下孵育3分鐘
6. 加入50微升HEPENGBIO陰性液(Reagent F)
7. 上下傾倒數(shù)次,混勻(限定在3秒之內(nèi))
8. 即刻放進分光光度儀檢測,此為背景空對照(0分鐘讀數(shù)-10分鐘讀數(shù))
 
四、 樣品測定
 
1. 移取750微升HEPENGBIO緩沖液(Reagent C)到新的比色皿
2. 加入100微升HEPENGBIO反應(yīng)液(Reagent D)
3. 加入100微升HEPENGBIO底物液(Reagent E)
4. 上下傾倒數(shù)次,混勻
5. 在25℃溫度下孵育3分鐘
6. 加入50微升待測樣品(100微克蛋白)(注意:樣品須清澈)
7. 上下傾倒數(shù)次,混勻(限定在3秒之內(nèi))
8. 即刻放進分光光度儀檢測,此為樣品讀數(shù)(0分鐘讀數(shù)-10分鐘讀數(shù))
 
五、計算樣品活性
 
[(樣品讀數(shù)-背景讀數(shù))X樣品稀釋倍數(shù)X 1(體系容量;毫升)]÷[0.05(樣品容量;毫升)X 6.22(毫摩爾吸光系數(shù))X 1(光徑距離;厘米)X 10(反應(yīng)時間;分鐘)]=單位/毫升÷(樣品蛋白濃度)毫克/毫升=單位/毫克 
 
單位=微摩爾NADPH/分鐘
 
六、 酶標儀測定
 
1. 在96孔板上做好相應(yīng)標記:背景對照和樣品
2. 分別移取150微升HEPENGBIO緩沖液(Reagent C)到96孔板里
3. 分別加入20微升HEPENGBIO反應(yīng)液(Reagent D)
4. 分別加入20微升HEPENGBIO底物液(Reagent E)
5. 輕輕搖動96孔板
6. 在25℃溫度下孵育3分鐘
7. 分別加入10微升HEPENGBIO陰性液(Reagent F)或待測樣品(50微克蛋白)到相應(yīng)孔里(注意:樣品須清澈)
8. 輕輕搖動96孔板
9. 即刻放進酶標儀檢測:獲得0分鐘和10分鐘讀數(shù)
10. 活性計算
 
[(樣品讀數(shù)-背景讀數(shù))X樣品稀釋倍數(shù)X 0.20(體系容量;毫升)]÷[0.01(樣品容量;毫升)X 6.22(毫摩爾吸光系數(shù))X 0.6(光徑距離;厘米)X 10(反應(yīng)時間;分鐘)]=單位/毫升÷(樣品蛋白濃度)毫克/毫升=單位/毫克 
 
單位=微摩爾NADPH/分鐘
 
注意事項
 
1. 本產(chǎn)品為20次(比色皿)和100次(96孔板)操作,包括背景對照
2. 操作時,須戴手套
3. 系統(tǒng)操作過程中,背景測定只需1次
4. 樣品須澄清,至關(guān)重要 
5. 孵育完成后即刻光度測定
6. 測定值由高到低變化;測定持續(xù)10分鐘
7. 樣本測定10分鐘讀數(shù)低于0分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
8. 光度測定后,比色皿須清洗徹底
9. 建議待測樣本蛋白濃度為100微克/50微升(本公司提供 HEPENGBIO Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒)
10. 如果待測樣品濃度過高或過低,可以調(diào)整樣品濃度
11. 醛糖還原酶單位活性定義為:在25℃,pH 6.2條件下,每分鐘內(nèi)能夠轉(zhuǎn)化1微摩爾葡糖醛酸至山梨醇所需的酶量作為一個活性單位
12. 本公司提供系列醫(yī)學(xué)生化經(jīng)典分析試劑產(chǎn)品
 
質(zhì)量標準
 
1. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感
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