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      赫澎(上海)生物科技有限公司
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      非蛋白質巰基含量檢測試劑盒說明書-可見分光光度法

      非蛋白質巰基含量檢測試劑盒說明書   可見分光光度法
      注意:正式測定之前選擇 2-3 個預期差異大的樣本做預測定。
      規格:50T/24S
      產品內容:
      提取液一:液體 25mL×1 瓶,4℃保存。
      提取液二:液體 25mL×1 瓶,4℃保存。
      試劑一:液體 50mL×1 瓶,4℃保存。
      試劑二:粉劑×1 瓶,4℃避光保存。臨用前加入 5mL 無水甲醇充分溶解備用。
      標準品:粉劑×1 支,10mg半胱氨酸,4℃保存。臨用前加入 1.65mL 提取液溶解為 50μmol/ml 的半胱氨酸標準溶液。
      提取液的配制:將提取液一和提取液二按體積比 1:1 的比例混合配制,按照樣本數量配制并在當天用完。
      產品說明:
      生物體內巰基主要包括非蛋白質巰基和蛋白質巰基。巰基化合物在體內具有重要的解毒功能, 對生物體的自我調節具有非常重要的生理意義。
      巰基基團與 5,5’- 二硫代-雙-硝基苯甲酸(DTNB)反應,生成黃色化合物,在 412nm 處有最大吸收峰。
      自備實驗用品:
      可見分光光度計、離心機、恒溫水浴鍋、1mL 玻璃比色皿、甲醇、研缽/勻漿器和蒸餾水。
      操作步驟:
      一、樣品的制備
      1、 動物、植物組織:稱取約 0.1g,加入 1mL 的提取液,制備成 10%的勻漿,10000g,常溫離心
      10min,取上清待測。
      2、   細胞:按照細胞數量(104 個):提取液體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議 500 萬細胞加入 1mL  提取液),超聲波破碎細胞(功率 300w,超聲 3 秒,間隔 7 秒,總時間 3min)然后 10000g,4℃離心 10min,取上清置冰上待測。
      3、   血清(漿),培養液:向 0.1mL 血清(漿)或培養液中加入 1mL 提取液,10000g,常溫離心10min,取上清待測。
      二、測定步驟
      1、分光光度計預熱 30min 以上,調節波長至 412nm,蒸餾水調零。
      2、將 50μmol/mL 標準溶液用提取液稀釋至 0.3、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.003125μmol/mL 的標準液,現用現配。
      3、操作表
       
      對照管
      測定管
      標準管
      空白管
      上清液(mL)
      0.3
      0.3
      -
      -
      標準品(mL)
      -
      -
      0.3
      -
      試劑一(mL)
      0.65
      0.65
      0.65
      0.65
      試劑二(mL)
      -
      0.1
      0.1
      -
      H2O(mL)
      0.1
       
       
      0.4
      混勻,室溫放置 10min,測定 412nm 吸光值,分別記為 A 對照、A 測定、
      A 標準、A 空白,計算?A 測定=A 測定-A 對照,算?A 標準=A 標準-A 空白。
      三、計算公式
      1、 標準曲線的繪制:
      以標準液濃度為 x 軸,?A 標準為 y 軸,繪制標準曲線,得到標準方程 y=kx+b,將?A 測定代入公式得到 x(μmol/mL)
      2、 非蛋白質巰基含量計算:
      (1) 按樣本鮮重計算:
      非蛋白質巰基含量(μmol/g 鮮重)=x×V 提取÷W=x÷W
      (2) 按血清、培養液體積計算:
      非蛋白質巰基含量(μmol/mL)=x×(V 提取+V 液體)÷V 液體=1.1×x。
      (3) 按細胞數量計算:
      非蛋白質巰基含量(μmol/104 cell)=x×V 提取÷500=0.002×x。
      V 提?。杭尤胩崛∫后w積,1mL;W:樣品質量,g;Cpr,樣本蛋白濃度,mg/ml;500:500 萬個細胞;V 液體:血清(漿)或培養液體積,0.1mL。
      注意事項:
      1、當吸光值大于 1.2 時,建議將上清液用提取液稀釋后測定;吸光值過小時,建議提高樣品質量或體積進行測定。
       
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